人ELISA試劑盒的正確使用說明講解

　　l 本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中人熱休克蛋白70(HSP-70)的含量。

　　l 有效期：6個月

　　l 保存條件：2-8℃

　　l 本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷

　　實驗原理

　　試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被人熱休克蛋白70(HSP-70)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人熱休克蛋白70(HSP-70)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值)，計算樣品濃度。

　　樣本處理及要求

　　1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

　　2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

　　3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果)，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

　　4. 細胞培養物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

　　注：標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

　　需要而未提供的試劑和器材

　　1. 酶標儀(450nm)

　　2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

　　3. 37℃恒溫箱

　　4. 蒸餾水或去離子水

　　試劑盒組成

　　名稱96孔配置48孔配置備注

　　微孔酶標板12孔×8條12孔×4條無

　　標準品0.3mL*6管0.3mL*6管無

　　樣本稀釋液6mL3mL無

　　檢測抗體-HRP10mL5mL無

　　20×洗滌緩沖液25mL15mL按說明書進行稀釋

　　底物A6mL3mL無

　　底物B6mL3mL無

　　終止液6mL3mL無

　　封板膜2張2張無

　　說明書1份1份無

　　自封袋1個1個無

　　備注：

　　1. 標準品濃度依次為：160、80、40、20、10、5 pg/mL

　　2. 經過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。

　　注意事項

　　1. 嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

　　2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

　　3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

　　4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用。

　　5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

　　6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。

　　7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

　　8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

　　9. 不能使用過期產品。

　　10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。

　　試劑準備

　　試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡后方可使用。

　　20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

　　操作步驟

　　1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

　　2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;

　　3. 樣本孔中加入待測樣本50μL;空白孔不加。

　　4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

　　5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350μL)，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。

　　6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

　　7. 每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

　　實驗結果計算

　　以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。

　　試劑盒性能：

　　1. 檢測范圍：5 pg/mL – 160 pg/mL。

　　2. 靈敏度：檢測濃度小于1.0 pg/mL。

　　3. 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

　　4. 重復性：板內變異系數小于10% ，板間變異系數小于15% 。

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