【本生生物】細胞培養基礎知識點

　　細胞培養是細胞和分子生物學中使用的最重要的工具之一，它為研究正常的生理學和生物化學提供了出色的模型系統(例如，代謝研究，衰老)，藥物和有毒化合物對細胞的影響以及細胞的影響 誘變和癌變。 它也用于藥物篩查和發育，以及生物化合物(例如疫苗，治療蛋白)的大規模生產。 將細胞培養用于這些應用中的任何一種的主要優點是可以通過使用一批克隆細胞獲得的結果的一致性和可重復性。

　　細胞培養是指從動物或植物中去除細胞，然后在有利的人工環境中生長。細胞可以在培養前直接從組織中取出并通過酶或機械手段分解，或者它們可以來源于已經建立的細胞系或細胞株

　　1.初級培養

　　原代培養是指細胞從組織中分離并在適當條件下增殖，直到它們占據所有可用基質(即達到匯合)后的培養階段。在這個階段，必須通過將細胞轉移到具有新鮮生長培養基的新容器中來對細胞進行傳代培養(即傳代)，以提供更多的繼續生長的空間。

　　2.細胞系

　　在第一次繼代培養后，原代培養物被稱為細胞系或亞克隆。來源于原代培養物的細胞系具有有限的壽命(即，它們是有限的)，當它們傳代時，具有最高生長能力的細胞占優勢，從而在群體中產生一定程度的基因型和表型一致性。

　　3.細胞株

　　如果通過克隆或其他方法從培養物中積極選擇細胞系的亞群，則該細胞系成為細胞株。細胞株通常在親本系開始后獲得額外的遺傳變化。

　　4.有限細胞系與連續細胞系

　　正常細胞在失去增殖能力之前通常只分裂有限的次數，這是一種遺傳決定的事件，稱為衰老;這些細胞系被稱為有限的。然而，一些細胞系通過一種稱為轉化的過程變得不朽，這種過程可以自發發生，也可以通過化學或病毒誘導。當一個有限的細胞系經歷轉換并獲得無限分裂的能力時，它就變成了一個連續的細胞系。

　　連續培養的細胞系容易發生遺傳漂變，有限的細胞系注定會衰老，所有細胞培養物都容易受到微生物污染，即使是運行實驗室也可能出現設備故障。由于已建立的細胞系是一種寶貴的資源，其替代品昂貴且耗時，因此將其冷凍保存以備長期儲存至關重要。

　　一旦從傳代培養中獲得少量剩余的細胞，應將其作為種子儲備冷凍，并加以保護，不得供一般實驗室使用。可從冷凍種子儲備中制備和補充工作儲備。如果種子儲備耗盡，然后，冷凍保存的工作儲備可以作為制備新鮮種子儲備的來源，從初始冷凍開始，產生數量的增加最小。

　　冷凍保存培養細胞的最佳方法是在液氮中，在培養基中，在二甲基亞砜(DMSO)或甘油等冷凍保護劑的存在下保存細胞。低溫保護劑可以降低介質的冰點，也可以降低冷卻速度，從而大大降低冰晶形成的風險，而冰晶形成會損害細胞并導致細胞死亡。

　　DMSO已知有助于有機分子進入組織。處理含有二甲基亞砜的試劑時，應使用適用于此類材料危害的設備和做法。按照當地法規處理試劑。

　　從冷凍工作細胞儲備中培養細胞：

　　確定傳代次數，例如，如果先前的細胞被冷凍，它們被解凍三次，解凍過程將是第四次傳代。

　　將生長培養基(基本培養基、小牛血清和抗生素)添加到標記有細胞系、傳代數和日期的T75燒瓶中

　　將燒瓶水平放置在37℃和5%CO2的CO2培養箱中至少15分鐘。這將使介質升溫并達到其正常pH值(7.0-7.6)

　　在37攝氏度的水浴中輕輕攪拌，使冷凍小瓶與細胞系解凍。為了降低污染風險，將O形圈和蓋子保持在水位以上(2-5分鐘)。

　　將小瓶放在生物安全柜(BSL-2)中。為避免污染，打開小瓶前，用70%乙醇擦拭。

　　將冷凍的細胞瓶內容物轉移到含有生長培養基的T75燒瓶中。輕輕混合并搖動燒瓶，使細胞均勻分布在燒瓶表面。

　　在37℃、5%CO2的CO2培養箱中培養燒瓶過夜。允許細胞整夜附著

　　改變增長：

　　將燒瓶在37℃、5%CO2下再培養2-4天，并監測直至細胞生長

　　一旦細胞達到約90%的匯合，可以使用T150燒瓶擴增細胞儲備

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